Radialfluss-Chromatographie

Um herauszufinden, wie die Radialflusschromatographie funktioniert und wie genau diese den Großteil der aktuellen Aufreinigungsanwendungen im Bereich des Downstream Processing unterstützen kann, müssen wir herausfinden, wie sie tatsächlich funktioniert und wie sich diese Technologie von der traditionellen bzw. axialen Säulentechnik unterscheidet.

Der erste und sehr offensichtliche signifikante Unterschied zu den weit verbreiteten axialen Chromatographiesäulen besteht in der Flussverteilung über das Bett und die Säule. Während bei der axialen Chromatographie der Fluss so einfach sein kann wie der sogenannte 'Gravitationsfluss', was bedeutet, dass der Fluss von oben nach unten in der Säule mit der Schwerkraft als treibende Kraft erfolgt aber auch so komplex sein kann, dass am oberen Kopf der axialen Säule eine aufwändige Verteilungstechnologie vorhanden sein muss, um sicherzustellen, dass die Probe beim Eintritt in das kurze, aber breite Säulenbett (in der präparativen/industriellen Chromatographie) gleichmäßig verteilt wird, bewegt sich die Probe mit der Radialflusstechnologie horizontal über das Bett. Der Eluent/die Probe tritt oben in die Säule ein, der obere Deckel fungiert als Verteilerkopf und leitet die Probe in den Raum zwischen dem äußeren Säulenkörper und dem der äußeren Fritte.

Die Probe verteilt sich über die gesamte Höhe der Säule und fließt horizontal von der äußeren Fritte zur inneren. Aus dem Spalt zwischen innerer Fritte und einem Verdrängerkörper (Zylinder in der Mitte der Säule) tritt der Eluent durch den Auslass am Boden der Säule aus. Die effektive Betthöhe der Säule ist der Abstand zwischen der äußeren und inneren Fritte. Dies führt natürlich zu einer festen Betthöhe, im Gegensatz zu den Plunger-Systemen, die oft bei axialen Säulen zu finden sind. Während bei einer Radialflusssäule eine bestimmte Menge an chromatographischem Material (in der Regel 120% des nominalen Säulenvolumens) für jede Art von Trennexperiment bereitstehen muss, bleibt die Trennung aufgrund der festen Betthöhe und des festen Volumens (oben gibt es auch keinen Plunger zur Abdichtung der Säule) hoch reproduzierbar. Darüber hinaus bleiben das Volumen und alle Bedingungen für die Trennung auf der jeweiligen Säule, sobald sie validiert ist, konstant, ohne Raum für Fehler, ohne das chromatographische Bett je anpassen zu müssen.

Die treibende Kraft dieser Art von Chromatographie ist der Druckunterschied zwischen der inneren (kleineren) und der äußeren (größeren) Fritte, der mit ihrem entsprechenden Unterschied der Oberfläche zu einer differentiellen Flussgeschwindigkeit führt. Der Fluss über eine jeweilige Oberfläche, der sich zum Zentrum der Säule hin erhöht, bewirkt, dass das spätere/innere Ende des Bettes einen höheren Rückdruck aufweist als die früheren/äußeren Teile des Bettes. So werden die Lösungsmittel horizontal über das Bett hinweg in präziser und reproduzierbarer Weise geleitet. Mit den im Vergleich zu axialen Säulen erheblich größeren Oberflächen ermöglicht dieses Säulendesign höhere Flussraten bei ähnlichen linearen Geschwindigkeiten und erhält die Wechselwirkungszeit zwischen Festphase und Eluent intakt.

Ein weiterer wichtiger Punkt, der als inhärenter Unterschied in der chromatographischen Leistung zwischen axialer und radialer Chromatographie erwähnt werden muss, ist die Verteilung des Eluenten. Während (zumindest bei größeren Maßstäben) axiale Säulen mit ihren Eluenten auf eine oft komplizierte Flussverteilung am Einlasskopf angewiesen sind, bevor dieser durch die erste Fritte in das Säulenbett gelangt, ist die Position im Radialfluss, bei welcher der Eluent in das chromatographische Bett eintritt, irrelevant und führt zu genau demselben Zustand/Trennzeit und der Verteilung wie bei jedem anderen Molekül. Ohne weitere potenziell fehleranfällige Verteilungstechnologie führt die Eluentenverteilung über das Säulenbett der axialen Flusschromatographie zu einer verbreiterten Gaußschen Kurve, da der schnellste und kürzeste Weg über Einlass, Säulenbett, Auslass (mitten durch die Säule) erheblich von dem breitesten und langsamsten Weg (äußere Enden der Säule) abweichen kann. Dies führt zu einer geringeren Trennauflösung und Schwierigkeiten bei der Analytik möglicher Mängel im Säulenbett. Bei der Radialflusschromatographie hingegen durchläuft der Eluent immer horizontal das Säulenbett. Da die Summe des Wegs vom Einlass zum Eintreten ins Säulenbett und des Wegs vom Verlassen des Säulenbetts zum Auslass immer konstant ist, ergibt sich in diesem Säulendesign eine höhere Auflösung und größere Reproduzierbarkeit der Peaks.

Wenn Prozesse übertragen oder vergrößert werden, insbesondere in der axialen Chromatographie, treten häufig Änderungen in der Betthöhe auf. In solchen Fällen ist die Sicherstellung einer konsistenten Trennung von entscheidender Bedeutung. Diese Konsistenz wird oft durch die Verweilzeit verankert, die die Dauer darstellt, die der Eluent benötigt, um mit der stationären Phase zu interagieren, wobei eine typische Verteilung entsteht.

Um eine ähnliche Trennung wie in Kleinversuchen zu ermöglichen, ist es entscheidend, dass die Wechselwirkung zwischen Eluent und stationärer Phase ausreichend lange und häufig erfolgt. In der axialen Chromatographie ist die Betthöhe in der Regel ein festgelegter technischer Parameter, der nicht verändert werden sollte. Als verbleibende Variable zur gezielten Festlegung einer bestimmten Verweilzeit dient daher die lineare Geschwindigkeit.

In der radialen Chromatographie hingegen bleibt die lineare Geschwindigkeit nicht konstant über die gesamte Bettlänge hinweg. Stattdessen zeigt sie Extreme, von der höchsten linearen Geschwindigkeit pro Volumen an der inneren Fritte (was zu kürzester Verweilzeit führt) bis zur niedrigsten linearen Geschwindigkeit an der Oberfläche der äußeren Fritte. Um eine praktikable und wünschenswerte Durchflussrate oder lineare Geschwindigkeit festzulegen, wird sie oft als Ring innerhalb des Bettbereichs des Säulenbetts geschätzt, der zwischen den beiden Fritten positioniert ist. Diese Durchflussrate kann beibehalten und bei Bedarf skaliert werden, ohne die Betthöhe oder die Säulentechnologie zu ändern. Aufgrund dieser nichtlinearen Verteilung der linearen Geschwindigkeit gewährleistet die radiale Chromatographie eine außergewöhnliche Präzision und Flexibilität, angetrieben durch ihr inhärentes Design und ihre physikalischen Eigenschaften.

Wie zuvor skizziert, ist ein Merkmal im Säulendesign die größere Oberfläche bei einem in der Regel kurzen Bett (wie es häufig in der präparativen Chromatographie anzutreffen ist). Dies führt zu einer gleichmäßigeren Verteilung /Konzentration des Eluenten, bei gleichbleibender linearer Geschwindigkeit zu einem wesentlich geringeren Rückdruck und ermöglicht daher eine erhebliche Beschleunigung der Trennungen gleicher Größenordnung. Dieser Effekt verstärkt sich nur, wenn Prozessschritte vorliegen, die nicht durch eine bestimmte lineare Geschwindigkeit begrenzt werden müssen, wie die Äquilibrierung der Säule mit der mobilen Phase und potenzielle Waschschritte zwischen der Probenbeladung und der Elution der Probe.

Die folgende Fallstudie untersucht das Potenzial zur Zeitersparnis durch die einzigartigen Eigenschaften der radialen Chromatographie bei der Aufreinigung eines intrazellulären bakteriellen Enzyms. Während die hier verwendete Säule ein viel größeres Volumen aufweist als die axiale Säule, bleibt die Bettgröße konstant, was zu ähnlichen Trennparametern führt. Mit der drastisch größeren Oberfläche und dem geringen Rückdruck kann der gesamte Trennprozess mit der radialen Fließsäule in weniger als der Hälfte der Zeit abgeschlossen werden. Dies geschieht unter Berücksichtigung eines konstanten Eluentenflusses (gemäß Säulenvolumen) und der Vorteile eines schnelleren Flusses während des Waschens und der Äquilibrierung. Die maximale Durchflussrate ist hier fast siebenmal so hoch, was die signifikanten Fähigkeiten der radialen Technologie in jeder Art von Chromatographieprozess verdeutlicht, bei dem eine chemische Interaktion zwischen mobiler und stationärer Phase stattfindet. Darüber hinaus wird nicht nur die Verarbeitungszeit verkürzt, sondern die Ausbeute wird aufgrund der Reduzierung der proteolytischen Degradation auf der Säule gesteigert, was zu einer um 10% höheren Beladekapazität führt.

Wir haben den inhärenten Vorteil des radialen Säulendesigns in Bezug auf Verarbeitungszeiten und Einschränkungen hinsichtlich Druckes oder linearer Geschwindigkeit festgestellt. Dies kann zu einer wesentlich höheren Leistung führen, und bei gleicher Säulengröße und Volumen, wenn eine Erhöhung der Produktmenge gewünscht wird, können auch ihre physischen Parameter genutzt werden, um einen ähnlichen Durchsatz bei geringeren Materialinvestitionen zu erzielen. Dies bedeutet, dass bei einer Verringerung der Säulengröße bei gleichbleibender Ausbeute das Potenzial besteht, die Menge chromatographischen Materials, die Arbeitsstunden und den Platzbedarf der Säule zu reduzieren. Als numerisches Beispiel könnte die Reinigung von 200 Litern pro Stunde entweder auf einer 160L axialen Chromatographiesäule in einem 3-Schicht-Betrieb oder auf einer 60 L radialen Chromatographiesäule in einer einzigen Schicht durchgeführt werden.

Als ein weiterer Anwendungsfall und eine der häufigsten Anwendungen in der radialen Chromatographie, die von namhaften Pharmaunternehmen etabliert wurde, besteht die Möglichkeit, die Kosten des Prozesses bei der Blutplasmafraktionierung zu senken. Die untenstehenden Daten stammen aus einer Plasmafraktionierungseinrichtung. Die Studie wurde durchgeführt, um die Leistung einer 20 L radialen Chromatographiesäule mit der einer 16 L axialen Chromatographiesäule zu vergleichen. Durch die Verwendung der radiale Fließchromatographie erhöhte sich der Durchfluss um das Dreifache, wobei die Trenngeschwindigkeit dreifach anstieg (Einschichtbetrieb gegen Dreischichtbetrieb), ohne die Produktgewinnung oder Reinheit zu beeinträchtigen. Die Kosten hier sind als Schätzung präsentiert, aber die Verringerung der Säulengröße (Volumen) um mehr als die Hälfte der anfänglichen Investition führt zu erheblichen Einsparungen.

Ein bedeutender Faktor in im Downstream Processing ist die Skalierung. Sobald Protokolle auf Forschungsebene etabliert sind, müssen sie auf eine größere Skala angepasst, getestet und validiert werden, um die Produktion für den entsprechenden Prozess und die Ernteerträge zu steigern. Mit zunehmender Säulengröße ändert sich in der Regel auch die Betthöhe, was es erschwert, den Forschungsprozess auf die industrielle Ebene zu übertragen. Da die Frittenoberfläche (pro Volumen) sich ändert, muss die lineare Geschwindigkeit ebenfalls neu bewertet werden. Mit der Änderung der Bettlänge müssen Rückdrücke, Durchflussraten und Präzision genau überwacht und gegebenenfalls angepasst werden.

Eine wichtige Erfindung, um diese potenziellen Ungenauigkeiten in der radialen Chromatographie zu beheben, kann die sogenannte Wedge-Säule sein. Wie der Name schon sagt, handelt es sich um einen Ausschnitt einer vollständigen radialen Säule, wobei jedoch die Betthöhe und das Oberflächenverhältnis von innerer zu äußerer Fritte konstant und vergleichbar mit einer vollständigen radialen Säule auf Industrieskala gehalten werden. Auf diese Weise wird das Volumen um den Faktor der Gesamtgröße der Säule und den Faktor des Ausschnittswinkels im Vergleich zum 360°-Design einer vollständigen radialen Säule reduziert. Dies bedeutet im Wesentlichen, dass alle Trennparameter mit dem Skalierungsprozess übereinstimmen, solange die Durchflussrate um den gleichen Faktor erhöht wird, um das Volumen zur endgültigen Säule größerer Skala zu berechnen. In der Fallstudie wurde dieselbe Konzentration von Rinderserum auf unterschiedlich große Säulen geladen. Eine Säule ist eine 400 ml Wedge-Säule, die andere eine 12 L radiale Chromatographiesäule, was zu einem Skalierungsfaktor von 30 führt. Allein durch Multiplikation der Probenmenge und der Durchflussrate mit diesem Faktor ergibt die Wedge-Säule ein überlagerbares Chromatogramm mit dem in dem tatsächlichen Versuch mit der echten Säule erhaltenen.

Abbildung 8: Die Wedge-Säule stellt ein ausgeschnittenes Stück einer Radialflusssäule dar, das die gewünschte größere Betthöhe, jedoch ein geringes Gesamtsäulenvolumen ermöglicht, indem nur ein Bruchteil des 360°-Stücks einer kompletten Radialflusschromatographiesäule zur linearen Skalierung mit minimalem Aufwand dient.

SuperFlo Wedge Säule ansehen

Mit dem zuvor erwähnten festen Säulenvolumen bei der Radialflusschromatographie, was sie als Säulendesign weitaus reproduzierbarer und zuverlässiger macht, hängt hinreichendes Packen nicht von der Fähigkeit und Erfahrung des jeweiligen Technikers ab, sondern ist allein auf die Komprimierbarkeit des Packungsmaterials und den Packdruck zurückzuführen. Durch Berücksichtigung der Komprimierbarkeit des Harzes bleibt der maßgebliche Faktor der Druck. Dies könnte jedoch potenziell automatisiert werden, um die Reproduzierbarkeit zu maximieren und den Arbeitsaufwand zu minimieren.

Das Packen mit der SuperFlo Radialflusssäule ist standardisiert, wobei die Säule durch den Auslass mit der Packungspuffer gefüllt wird, um etwaige verbleibende Luft durch die Packports zu verdrängen (oben auf der Säule, was die Luftentfernung intuitiv und unkompliziert macht), gefolgt von einer Umkehr des Flusses, eine Aufschlämmung des chromatographischen Materials aktiv durch die zuvor genannten Packports in die Säule zu pumpen. Der Puffer innerhalb des Säulenzylinders wird durch das Harz verdrängt (für die Ionenaustauschchromatographie wird das SepraFlo Material empfohlen) und durch (in der Regel) die äußere Fritte der Säule aufgrund ihrer größeren Oberfläche extrudiert. Auf diese Weise gibt es keine ungleichmäßige Kompression des chromatographischen Bettes, das nun das Harz enthält.

Durch das aktive Pumpen des Materials in die Säule kann leicht ein gleichmäßiger Säulendruck und eine gleichmäßige Kompression erreicht werden, ohne dass nachträgliche Anpassungen erforderlich sind (wie z.B. bei einem Kolben /Plungers, der in der Regel bei Axialflusssäulen verwendet wird). Das pumpengestützte Packen der Säule von oben ermöglicht ein aktives Packen bis zu einem gewünschten Packungsabschlussdruck, der nur durch das chromatographische Medium definiert ist und bietet eine gewisse Flexibilität bei der Auswahl der Pumpe. Die Durchflussrate maximiert /minimiert lediglich die Säulenpackgeschwindigkeit, nicht die Integrität des chromatographischen Bettes oder die Fähigkeit, einen festgelegten Druckschwellenwert zu erreichen. Selbstverständlich haben auch herkömmliche Packoptimierungstechniken ihre Berechtigung beim Packen einer SuperFlo Radialflusssäule. Als Beispiel führte die Packoptimierung mit einem gängigen HIC-Material, das auf stark komprimierbarer Agarose basiert, zu den besten Ergebnissen, wenn Salz hinzugefügt wurde, um das Medium vor dem Packen 'vorzuschrumpfen' bzw. komprimieren und die Pufferverdrängung durch aktives Packen auf beiden Fritten anzuwenden. Bei diesen komprimierbaren Materialien scheint eine verdünntere Suspension wünschenswert zu sein, was zu einer Anfangskonzentration von 25% (v/v) für diese Packoptimierung führte und die Suspension kontinuierlich mit dem durch die Säule verdrängten Puffer verdünnte. Auf diese Weise bleiben die Pumpengröße, die Geschwindigkeit und der Leistungsbedarf auch bei großen Säulen und komprimierbaren Materialien beherrschbar, um die Integrität, die Reproduzierbarkeit und die Benutzerfreundlichkeit in jeder Anwendung, jedem Material oder jeder Säulengröße sicherzustellen, die erforderlich ist.

Die dargestellten Vorteile, reproduzierbares und automatisierbares Packen, eine gleichmäßigere und genauere Flussverteilung, höhere Durchflussraten bei Aufrechterhaltung entscheidender linearer Geschwindigkeiten, niedrigere Rückdrücke und verbesserte Trennungen, kulminieren in der SuperFlo Radialflusssäule von Sepragen, den ursprünglichen Erfindern der Radialflusstechnologie. Mit Acryl- und Edelstahlmaterialien, die in einem Bereich von 50 ml bis 500 L und mehr erhältlich sind, ist das Säulendesign grenzenlos und erfüllt alle Anforderungen in der chromatographischen Anwendung mit chemischer Interaktion. Wedge-Säulen sind bereits ab 20 ml erhältlich, um die Skalierung und Erforschung der Trennung mit der SuperFlo Radialflusstechnologie einfach und mühelos durchzuführen. Während es Standardgrößen gibt, die sich in verschiedenen Branchen bewährt haben und über die Jahre zuverlässig im Einsatz bleiben, stehen individuelle Optionen sowohl für die Säulengröße und die Betthöhe als auch für die Materialien der Säule, die Anschlüsse und die Oberflächenbearbeitung zur Verfügung.

Abbildung 12: Beispielhafte Abbildungen einer 240 L Edelstahl-Produktionssäule (Betthöhe 15 cm), einer 100 ml Acryl-Laborsäule (Betthöhe 3,5 cm) und einer 20 ml Acryl-Wedge-Säule (Betthöhe 10 cm)